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“增免疫、抗疲劳”——所以叫我“抗衰老”
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青春宝抗衰老剂对实验性肾虚小鼠免疫功能的影响

中医认为机体衰老的原因之一是肾气虚衰。肾为先天之本,是机体生命活动的根本。现代大量资料表明,中医所说的肾之本质与西医泌尿、生殖、神经、内分泌、免疫系统有密切联系,肾虚与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴-性腺轴等老化有关,免疫系统老化又与内分泌系统功能退化同步,无论肾阴虚或肾阳虚均可导致衰老[1]。青春宝抗衰老剂是目前国内有较大知名度的抗衰老中成药,由红参、生地黄、天冬、麦冬等多昧药材组成,具有补泻兼备,寓补于泉,秉性中和,调理适度的特点,为了进一步探讨其作用机制,本实验观察了青春宝抗衰老剂对“劳倦过度、房事不节”诱导的肾阳虚模型小鼠免疫功能的变化。

[摘要]

目的

观察青春宝抗衰老剂对“劳倦过度、房事不节”诱发的肾虚小鼠兔疫功能的影响。

方法

选健康雄性昆明种小鼠54只,随机分为6组:空白对照组、模型对照组(劳倦过度+房事不节组)、青春宝抗衰老剂高、中、低剂量组和补肾方(金匮肾气丸)对照组。采用强迫小鼠游泳方法造成劳倦过度,以Colldege效应诱导雄性小鼠房事不节,建立肾虚小鼠模型,观察各组胸腺指数、脾指数、脾淋巴细胞增殖能力和NK细胞活性等免疫指标的变化。

结果

模型对照组小鼠胸腺指数、脾指数、脾淋巴细胞增殖能力和NK细胞活性指标较空白对照组明显下降(P<0.05,P<0.01);青春宝抗衰老剂高、中、低剂量组及金匮肾气丸组各项免疫学指标较模型对照组明显升高(P<0.05,P<0.01)。

结论

青春宝抗衰老剂能明显提高肾虚小鼠的免疫功能,进一步表明中医肾在免疫调节中主导作用。

[关键词] 青春宝抗衰老剂,房事不节,劳倦过度,肾虚,免疫

Effect of Qingchunbao on immune function of mouse models with kidney deficiency

(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center, Hangzhou 310053, China)

[Abstract] Objective: To observe changes of Qingchunbao on immune function of mice models with kidney deficiency。

Methods: 54 healthy male mice were categorized into six groups randomly: normal control group, model control group (over-fatigue plus sexual overstrain group), low, middle, high doses of Qingchunbao groups and Golden Chamber Pill group。 Over-fatigue model could be made by forcing mice to swim and deficiency of kidney Yang by colldege effect to induce sexual overstrain in male mice。 Qingchunbao and Golden Chamber Pill could serve as medication。 Changes of immune indexes (thymus index, spleen index, spleen lymphocyte proliferation and NK cell activity test) were examined in different groups。

Results: Immune indexes in model group were lower than those in control groups (P<0.05,P<0.01), while they were higher in Qingchunbao groups and Golden Chamber Pill group (P<0.05,P<0.01),compared with those in model group。

Conclusion: Qingchunbao could be improved the immune function in mouse models with kidney deficiency, and it is further proved that kidney places a leading role in the immune regulation。

[Keywords] Qingchunbao, over-fatigue, sexual overstrain, deficiency of kidney, immune


【下文具体实验情况】

1材料与方法

1.1 试验药物

青春宝抗衰老剂浸膏粉,棕褐色粉末,批号:080320,由正大青春宝药业有限公司提供;金匮肾气丸,批号:8030876,由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产。

1.2 实验动物

SPF级KM小鼠,2-3月龄,雄性54只,体重35~42g,雌性400只备用,25~30g,由中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2007-0005]。饲养于SPF级设施[SYXK(浙)2003-0003]。室温23±2℃,相对湿度60%~70%。

1.3 主要仪器和试剂

AG204-电子分析天平(瑞士METTLER),BIO-Rad酶标仪(美国BIO-Rad公司),CO2培养箱(美国thermo公司),RPMA1640完全培养液、四甲基戊唑蓝(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)、LPS-脂多糖,Sigma公司,苯甲酸雌二醇注射液(070902),由上海通用药业股份有限公司生产。

1.4 方法

1.4.1动情期雌鼠的准备及雄鼠的筛选:(1)动情期雌鼠的准备:给雌性小鼠灌胃苯甲酸雌二醇,3天后雌鼠进入动情期,以阴道涂片检查角化细胞程度证实之,用来诱导房事不节。(2)雄鼠的筛选:将每只雄鼠与两只动情期雌鼠共笼,次日取出雌鼠有阴道栓笼中的雄鼠为实验用雄鼠。

1.4.2 实验分组与造模方法:取雄鼠KM小鼠54只,随机分为6组,每组9只。即①空白对照组:常规饲养,每日灌胃蒸馏水10ml/kg;②模型对照(房事不节加劳倦过度)组:每天9:00在水深30cm,直径24cm,高45cm,水温为24±2℃的圆型桶,强迫雄性小鼠每日游泳一次,至小鼠精疲力尽即将下沉时捞起,以诱导劳倦过度;每只雄鼠与4只雌鼠同笼,注意及时更换动情期雌鼠以诱导房事不节,每天灌胃蒸馏水10ml/kg;③青春宝抗衰老剂高剂量组:造型方法同模型对照组,每天灌胃青春宝抗衰老剂浸膏粉1.2g/kg;④青春宝抗衰老剂中剂量组:造型方法同模型对照组,每天灌胃青春宝抗衰老剂浸膏粉0.6g/kg;⑤青春宝抗衰老剂低剂量组:造型方法同模型对照组,每天灌胃青春宝抗衰老剂浸膏粉0.3g/kg;⑥补肾方对照(金匮肾气丸)组:造型方法同模型对照组,每天灌胃金匮肾气丸2.6g/kg;所有动物给药容量为10ml/kg,连续给药4周。

1.4.3 观察指标

1.4.3.1对雄性小鼠脾脏和胸腺指数的影响:无菌取血后,处死小鼠,迅速取脾脏、胸腺,用生理盐水洗去血迹,剥净表面粘连组织,滤纸吸干表面水分后,以分析天平称重,并计算脏器系数。脏器系数(mg/10g)=脏器重量(mg)/体重(g)×10

1.4.3.2 ConA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT 法)

无菌条件下取小鼠的脾脏,加适量Hank’s液研磨,以200目不锈钢网滤过,1500r/m离心5分钟,弃上清,加Hank’s液重复洗涤2次。收集脾细胞,加适量RPMI 1640培养液混悬,以0.4%台盼兰拒染法计数,活细胞数不小于95%,加RPMI 1640完全培养液稀释,并调整细胞浓度至1×107个/ml。于96孔微量板中,每孔加100 ml脾细胞悬液(1×107 cell/ml)和等体积的Con A溶液(终浓度为5μg/ml)、LPS溶液(终浓度为10μg/ml) 或RPMI 1640培养液,重复3孔。另设空白对照组。37℃、5%CO2培养44h后,各孔加入50μl MTT溶液(2mg/ml),继续培养4h。1000r/m离心5分钟,弃去各孔上清,分别加150μl酸性DMSO溶液,振荡,于室温暗处放置15min,以酶标仪于波长578nm处测定OD值,并按下式计算刺激指数(SI):SI(刺激指数) = 不加有丝分裂原培养物的OD值。

1.4.3.3K细胞活性测定

实验前24 h 将靶细胞YAC-1传代培养,应用前以 Hank’s 液洗 3 次,用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为2×105 个/ml。无菌取脾,制备脾细胞悬液,用Hank’s液洗2 次 ,每次离心10 min(1000 r/ min)。弃上清将细胞浆弹起,加入 0.5 ml 灭菌水裂解红细胞,20 s 后再加入 0。 5ml 2 倍 Hanks 液及 8 ml Hanks 液,离心 10 min(1000r/ min),用 1 ml 含10 %小牛血清的 RPMI1640 完全培养液重悬,用1 %冰醋酸稀释后计数,调整细胞浓度为1×107 个/ ml 。将靶细胞加入 96 孔培养板,每孔100μl,试验孔加入100μl 脾细胞(效靶比 50:1) ,自然释放孔加入100μl 培养液,最大释放孔加入100μl 2 %NP40,37℃培养 4 h,离心,取上清 100μl 置96 孔酶标板中,加入LDH 基质液 100μl,反应8 min ,以30μL 1mol/L 的 HCl 终止反应 ,在酶标仪 492 nm 处测定 OD 值。

N K 细胞活性( %) =(反应孔OD -自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100%

1.5 统计方法

所有数据以`x±s表示,组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较用Dunnett-t检验,检验水准定为α=0.05(数据均用SPSS12.0统计软件处理)。

2 结 果

2.1 青春宝抗衰老剂对实验性肾虚小鼠一般情况观察

造模期间,空白对照组小鼠活动正常,皮毛光泽,反应灵活,饮食正常;随着时间的延长,模型对照组小鼠逐渐出现精神萎靡不振,形体瘦弱,皮毛不光泽,竖毛现象明显,畏寒怕冷,自主活动明显减少,喜蜷卧,拥挤在一起,反应迟钝,阴囊皱缩,睾丸回升等肾阳虚症状;与模型对照组比,给予高、中、低剂量的青春宝抗衰老剂浸膏粉和补肾方金匮肾气丸后,均能不同程度的改善肾阳虚症状,小鼠皮毛有光泽,竖毛现象不明显,反应较为灵活等。

2.2青春宝抗衰老剂对实验性肾虚小鼠免疫器官发育的影响

造模4周后,与空白对照组比,模型对照小鼠的胸腺指数和脾脏指数显著降低(P<0.05,P<0.01);给予高、中、低剂量的青春宝抗衰老剂浸膏粉和补肾方(金匮肾气丸)后,均能不同程度的提高小鼠胸腺指数和脾脏指数,其中青春宝抗衰老剂浸膏粉高剂量组能显著提高小鼠胸腺指数和脾脏指数(P<0.05,P<0.01),中、低剂量组显著提高小鼠胸腺指数(P<0.01);与补肾方(金匮肾气丸)组比较,青春宝抗衰老剂浸膏粉的作用略优于与金匮肾气丸,但差异不显著(P>0.05);说明青春宝抗衰老剂对肾阳虚小鼠具有提高机体免疫力的作用(结果见表1)。

表1 青春宝抗衰老剂对实验性肾虚小鼠免疫器官发育的影响


注:与空白对照组比,△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比,* P<0.05,** P<0.01;与补肾方对照组比,# P<0.05,## P<0.01。

2.3 青春宝抗衰老剂对实验性肾阳虚小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤能力的影响

造模4周后,与空白对照组比,模型对照小鼠脾淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤能力均有所降低趋势,其中小鼠T淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤能力降低显著(P<0.05);与模型对照组比,给予高、中、低剂量的青春宝抗衰老剂浸膏粉和补肾方(金匮肾气丸)后,均能不同程度的提高小鼠T、B淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤能力,其中高、中剂量的青春宝抗衰老剂浸膏粉组能显著提高T、B淋巴细胞增殖能力和NK细胞杀伤能力(P<0.05,P<0.01),低剂量组和补肾方(金匮肾气丸)组能显著提高NK细胞杀伤能力(P<0.05);与补肾方(金匮肾气丸)组比较,青春宝抗衰老剂浸膏粉的作用略优于与金匮肾气丸,但差异不显著(P>0.05)(结果见表2)。

表2 青春宝抗衰老剂对劳倦过度、房事不节肾阳虚小鼠免疫功能的影响


注:与空白对照组比,△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比,* P<0.05,** P<0.01;与补肾方对照组比,# P<0.05,## P<0.01。

3讨 论

中医理论认为“房事不节、损伤精气,劳则气耗,久劳及肾”,本模型便是在房劳精耗伤肾,可以影响生育的中医理论指导下,依据雄性啮齿类动物,在1小时内可与一动情期雌性动物交配数次,当出现呆滞疲劳状态时,投入另一只新的动情期雌性动物,又可立即兴奋起来而进行交配的coolidge效应[2],进行造模的。另外,本研究采用力竭游泳致疲劳,复合房事不节法成功复制出了肾阳虚模型,且其主要症状表现为生殖机能低下,符合“肾主生殖”的中医理论,该模型完全遵循经典的中医理论,按照中医病因发病机理复制模型,它更符合中医“证”的概念。本实验造模的关键是必须拥有充足的、健康的、在动情期的雌性动物,所以将4只动情雌性小鼠同时与1只雄性小鼠合笼,轮换使用。发现雌性小鼠状态不佳时,便更换新的状态好的雌性小鼠。

中医学认为,肾为先天之本,肾藏精是肾的主要生理功能之一。精是构成人体的基本物质,也是人体各种功能活动的物质基础。精能化气,肾精所化之气称为“肾气”。肾的精气盛衰,关系到生殖和生长发育的能力。肾藏元阴元阳,“元阴”又称“真阴”,是人体阴精之根本,对各脏腑起着濡润、滋养的作用。“元阳”又称“真阳”,是人体阳气之根,对各脏腑起着温煦、生化作用,故古代医家认为肾为五脏之本。肾脏有病必影响其他脏腑之功能;脏腑有病,久必及肾。因此,肾气盛衰决定着人体的健康状况。肾气充盛,则五脏六腑功能正常,人体正气充盛则健康无病[3]。现代医学研究证明,人类免疫细胞均来源于骨髓的造血干细胞,它们的发育成熟与骨髓中的微环境有关,进一步说明肾对人体免疫系统的影响和重要作用。亦有临床研究表明[4],肾虚患者,不论是肾阳虚还是肾阴虚,其外周血NK活性以及单核细胞IL-2和IL-2受体表达均显著低于正常对照组,尤以肾阳虚更为显著。大量研究表明,肾虚患者常有免疫功能的紊乱,而补肾药有一定的免疫调节作用。本实验研究结果表明,“劳倦过度、房事不节”肾阳虚小鼠模型除了出现虚损性的变化外,还表现了明显的免疫功能的紊乱,主要表现为胸腺、脾脏、脾淋巴细胞增殖能力以及NK细胞活性均显著的降低,而给予青春宝抗衰老剂浸膏粉和金匮肾气丸后,小鼠的免疫学指标均得到改善,从而证实青春宝抗衰老剂通过调节下丘脑、神经内分泌免疫网络、下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴途径,发挥中医肾在免疫调节中主导作用,增强机体的抵抗力。

[参考文献]

[1]蔡定芳,沈时谋,陈晓红,等。仙灵脾减轻外源性糖皮质激素抑制神经内分泌免疫作用的临床与实验研究[J]。中国中西医结合杂志,1998,18(1):4-7。

[2]朱传义,佩天任,徐宝林。肾虚动物模型初报[J]。中药药理与临床,1987,3(3):51。

[3]颜亭祥,李震,陶汉华,等。“劳倦过度房室不节”肾阳虚模型小鼠免疫功能的观察[J]。 山东中医药大学学报,2007,31(1):79-81。

[4]戴勇,余瑛,蔡体育,等。肾虚病人N K活性及IL-2受体表达的研究[J] 。中医研究,1993;6 (1) :19。


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